如何養(yǎng)出“漂亮”的懸浮細胞？

實驗室培養(yǎng)的細胞種類可以大致分為貼壁細胞和懸浮細胞兩種，只有極少數(shù)類型細胞同時存在兩種狀態(tài)。

  懸浮細胞是指不需要依賴支持物，可在培養(yǎng)基中以懸浮狀態(tài)生長的一類細胞，如淋巴細胞和大部分血液系統(tǒng)來源細胞。（如小鼠白血病細胞WEHI-3, 人白血病細胞K-562, HL-60）。工業(yè)上也有越來越多的貼壁傳代細胞被馴化出來，進行全懸浮的培養(yǎng)。目前在工業(yè)中應用的主要有SP2/0、NS0、CHO、BHK和HEK293細胞等，它們主要用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)；在獸用生物制品中常用的傳代細胞主要有采用全懸浮培養(yǎng)的BHK21細胞、MDCK細胞；及借助微載體懸浮培養(yǎng)的Vero細胞、PK細胞、ST細胞、 Marc145細胞等，每種細胞的特性都不同。

一般情況下，懸浮細胞相較于貼壁細胞的處理更加簡單一些，因為懸浮細胞傳代時無須胰酶消化。但這并不意味著懸浮細胞比貼壁細胞好養(yǎng)，對新手來說，反而更具挑戰(zhàn)性。總是會遇到各種各樣的問題：比如，為什么總是出現(xiàn)死細胞和細胞分化；說好了傳代很easy的，結(jié)果會出現(xiàn)分化；養(yǎng)好了凍存復蘇后又出現(xiàn)問題了！

接下來，我們一起探討一下關(guān)于培養(yǎng)懸浮細胞的幾個要點吧：

要點一：足夠的耐心，這是非常必要的  

很多懸浮細胞在剛從凍存狀態(tài)復蘇時活力是相對較差的，此時我們需要有足夠的耐心，等待細胞完成自我修復進入對數(shù)增長期。比如THP-1（人單核細胞白血病）從解凍到恢復正常增殖往往需要7-10天的恢復期；Jurkat，Clone E6-1(人T淋巴細胞白血病細胞)復蘇后也需要5-7天才能恢復到凍存前的狀態(tài)。新手可能會在此期間放棄培養(yǎng)，所以，請多一點耐心哦！培養(yǎng)這類細胞也是培養(yǎng)耐心的過程呢！

要點二：接種密度的把握

一般來說，懸浮細胞接種時密度不應低于50萬個/ML，很多懸浮細胞有密度依賴，密度低導致的不增殖也是新手常見問題之一。當然，有極少數(shù)細胞在密度高時反而狀態(tài)變差，如W6/32（小鼠B細胞雜交瘤細胞）。因此，培養(yǎng)不了解的細胞前查找相關(guān)資料去掌握細胞特性非常重要，知己知彼，方能百戰(zhàn)不殆嘛！

要點三：換液方法及頻率

換液頻率不應該被限制得“明明白白”，細胞是活物，在一個連續(xù)培養(yǎng)周期內(nèi)，視細胞生長狀態(tài)可分多次添加補充培養(yǎng)基、葡萄糖等特定營養(yǎng)成份，維持細胞良好的生長狀態(tài)。懸浮培養(yǎng)過程中，隨著細胞的增殖，原有培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的增加，細胞的活率會下降，及時補充營養(yǎng)物質(zhì)，使細胞處于一個相對良好的生存環(huán)境。這里就不再贅述，切忌頻繁離心換液。下面著重聊一聊換液方法：

①離心全換液法?

即通過離心（800-1000rpm，5min）去除全部舊的培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。該方法適合“皮實“好養(yǎng)的懸浮細胞換液(如K562)，或者當前細胞狀態(tài)良好、密度較高導致培養(yǎng)基消耗較大的情況。此方法的優(yōu)點是換液*，能去除部分細胞碎片，但是同樣會對細胞造成一定程度的機械損傷。

②離心半換液法

即通過離心（800-1000rpm，5min）50%細胞懸液，更換50%體積的新鮮培養(yǎng)基。該方法適合比較“矯情“難養(yǎng)的細胞（如thp-1），或者正在調(diào)整狀態(tài)中、密度較低但碎片較多需要去除的情況。

③沉降換液法

即不使用離心機而是利用重力自然沉降的方法，將培養(yǎng)基與細胞分離，達到全部或部分更換新鮮培養(yǎng)基。但是其有應用局限性—只適合能成一定大小細胞團（否則無法自然沉降，只能低速離心）的細胞，尤其是處理依賴細胞聚集才能增殖的細胞時非常值得推薦，如NK-92、NK-92 MI、Jurkat。該方法能在換液過程中最大限度避免離心過程造成的機械損傷，同時保留聚集的細胞團，并且去除細胞碎片也較為*。

掌握了以上幾點，再加上一株好的細胞種子，養(yǎng)出“漂亮“的懸浮細胞就指日可待啦！